FXR-α調(diào)控腸肝循環(huán)以及膽汁酸的生物合成，通過控制基因的表達(dá)，如小二聚體伴侶（SHP；NR0B2）抑制其它核受體的活性。FXR-α介導(dǎo)的SHP也發(fā)揮下調(diào)肝臟脂肪酸、甘油三酸酯生物合成以及被固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白1c介導(dǎo)的極低密度脂蛋白的產(chǎn)生。這表明除了控制膽汁酸穩(wěn)態(tài)，膽汁酸可以作為常規(guī)的代謝整合者發(fā)揮功能。

這里我們展示在小鼠中膽汁酸能夠增強(qiáng)褐色脂肪組織中的能量代謝，防止肥胖和胰島素抵抗。這種新發(fā)現(xiàn)的膽汁酸代謝效應(yīng)是嚴(yán)格依賴于環(huán)磷腺苷依賴甲狀腺激素激活酶2型酶甲狀腺素去碘酶（cyclic-AMP-dependent thyroid hormone activating enzyme type 2 iodothyronine deiodinase，D2）的誘導(dǎo)，因?yàn)樵贒2敲除小鼠中這種效應(yīng)是不存在的。用膽汁酸處理棕色脂肪和人類骨骼肌細(xì)胞能提高D2活性和耗氧作用。這些效應(yīng)不依賴于FXR-α，事實(shí)上是膽汁酸結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體TGR5，提高cAMP來介導(dǎo)的。

嚙齒動物和人類中，發(fā)揮生熱作用的重要組織均特異性的受這個機(jī)制控制，因?yàn)楣餐�表達(dá)D2和TGR5。因此膽汁酸BA-TGR5-cAMP-D2信號通路是一條微調(diào)能量平衡關(guān)鍵性機(jī)制，能夠作為改善代謝控制的靶標(biāo)。

1、膽汁酸安全高效控制體重

為了研究膽汁酸BAs的代謝作用，我們給小鼠高脂飲食（HFD）并添加0.5% w/w膽酸（cholic acid，CA）。長達(dá)47天內(nèi)添加膽酸對小鼠完全沒有毒副作用。沒有毒副作用體現(xiàn)在飼喂膽酸并不影響小鼠采食、營養(yǎng)的吸收以及血清肝臟酶活（圖1a）。

飼喂高脂飲食的小鼠相對對照組體重增加，補(bǔ)充膽酸后高脂飲食小鼠體重增加與正常飲食小鼠相似。正常飲食下補(bǔ)充膽酸對小鼠體重增加沒有影響。體重增加的改變主要體現(xiàn)在脂肪的變化：飼喂高脂飲食的動物附睪白色脂肪組織（WAT），腸系膜WAT，以及肩胛區(qū)棕色脂肪（BAT）重量顯著增加。

高脂飲食下BAT泛白，表明代謝活力的降低以及脂肪堆積的增加。另外，BAT周遭的WAT也出現(xiàn)增大。額外添加CA完全阻止了高脂飲食造成的脂肪組織和形態(tài)上的改變（圖1c）。日糧中添加CA逆轉(zhuǎn)了120天飲食誘導(dǎo)的體重增加（圖1d）。當(dāng)肥胖的小鼠日糧更換為含有CA的糧食（F-FA），小鼠的30天內(nèi)體重就恢復(fù)到正常水平，主要是WAT的減少（圖1e）。除了阻止和逆轉(zhuǎn)飲食誘導(dǎo)的肥胖，CA同樣提高了高脂飲食小鼠的糖耐受。在一項(xiàng)獨(dú)立的試驗(yàn)中，小鼠飼喂高脂飲食中添加人工FXR-α激動劑GW4064，并沒有觀察到抗飲食誘導(dǎo)肥胖的結(jié)果（圖1f）。

日糧中添加CA同樣使小鼠體脂降低，主要是WAT的降低。隨著體脂的降低葡萄糖的耐受性升高。飼喂CA對于能量穩(wěn)態(tài)與BA池大小及血清中BA水平以及BA組分的變化是一致的（圖1g）。膽酸CA、牛磺膽酸（TCA）、脫氧膽酸（DCA）以及�；撬崦撗跄懰幔═DCA）均顯著升高。這些變化很可能會影響不同的BA信號通路。這些結(jié)果顯示CA飲食阻止和逆轉(zhuǎn)脂肪沉積以及相關(guān)的新陳代謝結(jié)果并不僅僅依賴于FXR-α，還存在其他的作用機(jī)制。

圖1 CA降低高脂飲食小鼠的脂肪

a，b，47天里累積攝食（a）和體重（b）的變化；正方形：粗飼（Ch）；圓圈：高脂飲食（F）；三角形：高脂飲食加CA（FA）。c，附睪白色脂肪（epWAT）的比較。d，小鼠體重的變化。120天后高脂飲食小鼠一半轉(zhuǎn)為飼喂FA飲食（黑色三角）。e，比較epWAT重量。F-FA組為更換糧食組。f，1個月后小鼠食物攝入以及體重（BW），GW4064為人工合成FXR-α激動劑（FG，HF加GW4064）。g，21天不同飲食下小鼠膽汁酸池及血清中膽汁酸組分。Glyco（糖G），Hyo（豬H），Urso（熊U），Muri（鼠M）。ChA，粗飼添加膽酸CA。

2、膽汁酸促進(jìn)脂肪燃燒供能

相較于高脂飲食以及正常飲食小鼠，在含有CA的高脂飲食小鼠中，使用間接量熱法檢測到更高的CO₂產(chǎn)出以及O₂的消耗（圖2a），表明活躍的能量合成代謝。飼喂CA降低了高脂飲食誘導(dǎo)的呼吸商（RQ），證明CA增加了脂肪的氧化。為了檢驗(yàn)脂肪燃燒供能增加，我們實(shí)施了一項(xiàng)詳盡的關(guān)鍵代謝組織的組織學(xué)分析。在WAT及BAT中高脂飲食會引起脂肪組織細(xì)胞過度增大，添加CA的高脂飲食則沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。電子顯微鏡分析BAT發(fā)現(xiàn)，與高脂飲食相比，添加CA增加了線粒體中片狀脊的數(shù)量，說明BAT在CA誘導(dǎo)的能量消耗過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖2b）。

我們使用芯片試驗(yàn)比較了來自飼喂高脂飲食以及添加CA或者鵝脫氧膽酸（CDCA）后高脂飲食小鼠的肝臟及BAT基因表達(dá)圖示。主要的變化是肝臟基因的表達(dá)與膽固醇以及BA合成，但沒有表現(xiàn)出體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)（數(shù)據(jù)未顯示）。在BAT中，參與控制能量代謝的若干基因被BAs上調(diào)表達(dá)。我們主要關(guān)注受到影響最大的D2基因。D2轉(zhuǎn)化未活化的甲狀腺素（T4）為活化的3,5,3’-3碘化甲狀腺氨酸（T3），并且是表達(dá)D2的細(xì)胞中的甲狀腺激素受體飽和狀態(tài)關(guān)鍵的決定因素。D2在體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的不可或缺的作用已經(jīng)在小鼠中得到驗(yàn)證，BAT適應(yīng)性產(chǎn)熱就是依賴于該酶。

我們采取反轉(zhuǎn)錄定量試驗(yàn)驗(yàn)證了BAs處理的D2，測定了參與體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的基因的mRNA以及肝臟、肌肉及BAT中的BA信號。在能量消耗中的關(guān)鍵基因如PGC1α、PGC-1β、UCP-1、UCP-3、ACO、mCPT-I以及D2，在飼喂BA后的BAT中均上調(diào)表達(dá)（圖2c）。在肝臟和肌肉中并沒有發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。在任何情況下在BAT中FXR-α以及SHP的表達(dá)都沒有檢測到，但是我們確認(rèn)了肝臟中BAs誘導(dǎo)了SHP（圖2c）。FGFR-4，另一個參與到BA信號中的基因，僅在肝臟中檢測到大量表達(dá)。另外，使用GW4064處理并沒有誘導(dǎo)像CA處理那樣的產(chǎn)熱基因的應(yīng)答（數(shù)據(jù)未顯示）。這些結(jié)果確認(rèn)BAT是BAs在小鼠中新陳代謝結(jié)果的主要靶標(biāo)，BAs在體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的增益效果不僅僅依賴于FXR-α。

圖2 CA提高能量代謝水平

a，不同飲食下4個月小鼠（n = 3，26周齡）O2消耗，CO2產(chǎn)生以及RQ（呼吸商）。適應(yīng)時間2小時。O2消耗以（體重）0.75比標(biāo)準(zhǔn)化。陰影區(qū)域指示黑暗時間階段。方形，粗飼（Ch）；環(huán)形，高脂飲食（F）；三角形，高脂飲食加CA（FA）。b，透射電鏡肩胛區(qū)棕色脂肪BAT分析。比例尺1 μM。C，mRNA相對表達(dá)水平：PGC-1a、PGC-1b、UCP-1、UCP-3、ACO、mCPT-I、D2、FXR-a以及SHP，BAT（肩胛區(qū)棕色脂肪B），liver（肝臟L），muscle（肌肉M），ND，未檢出（not detectable）。白框，粗飼Ch；黑框，高脂飲食F；灰框，高脂飲食補(bǔ)充膽酸FA。

3、膽汁酸控體重依賴于D2基因

在棕色脂肪中，檢測發(fā)現(xiàn)高脂飲食下補(bǔ)充膽酸能夠顯著提高D2基因的表達(dá)。為驗(yàn)證D2在膽汁酸發(fā)揮作用的過程中的功能，我們在小鼠中敲除了該基因。結(jié)果顯示，在D2缺失的情況下，飼喂高脂飲食并添加CA的小鼠抗肥胖的表型消失，結(jié)果見圖3。D2突變小鼠中，高脂飲食補(bǔ)充膽酸CA后，附睪白色脂肪量及棕色脂肪量與對照組相比差異不顯著（圖3b），小鼠的體重也沒有得到控制，與高脂飲食下的小鼠表現(xiàn)一致（圖3a）。電鏡檢測小鼠棕色脂肪細(xì)胞，高脂飲食補(bǔ)充膽酸CA的D2突變小鼠并沒有表現(xiàn)出抑制脂滴堆積，即CA促進(jìn)脂肪燃燒的效果消失（圖3c）。

在小鼠和人類D2基因的啟動子上存在一個功能性cAMP應(yīng)答元件（CRE）。TGR5是唯一已知的通過制造cAMP以及后續(xù)PKA信號通路的激活來應(yīng)答膽汁酸的G蛋白受體。試驗(yàn)證實(shí)膽汁酸誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生需要通過TGR5（圖3d）。隨著膽汁酸升高，BAs-TGR5互作及PKA信號增強(qiáng)（圖3e）。TGR5以及D2均在小鼠大腦及BAT中共同高表達(dá)（圖3f）。膽酸能夠明顯升高BAT中cAMP的水平（圖3g）。

以上結(jié)果均表明膽汁酸作用于小鼠棕色脂肪BAT主要是通過G蛋白偶聯(lián)受體如TGR5以及激活PKA信號通路有關(guān)。

4、膽汁酸BA-cAMP-D2-T3信號通路調(diào)控能量代謝

為驗(yàn)證膽汁酸BAs確實(shí)是通過TGR5來對cAMP及D2進(jìn)行調(diào)控，我們選擇了特異性的TGR5激動劑benzyl 2-keto-6-methyl-4-(2-thienyl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate（圖4f）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛磺膽酸TCA對TGR5的激活作用要更強(qiáng)于該TGR5激動劑（圖4f）。此外TGR5激動劑增強(qiáng)了HSMM細(xì)胞中D2的活性，說明膽汁酸對D2的作用可能是通過TGR5（圖4g）。

最后我們研究了膽汁酸處理的人類肌肉細(xì)胞HSMM的耗氧情況及胞外酸化率。耗氧檢測是一種研究線粒體氧化反應(yīng)的方法，細(xì)胞外酸化率則是檢測糖酵解、乳酸生產(chǎn)以及厭氧代謝的方法。牛磺膽酸TCA促進(jìn)線粒體氧化反應(yīng)的作用與T3一致（圖4h）。暗示膽汁酸能夠誘導(dǎo)D2，促進(jìn)胎牛血清中的T4轉(zhuǎn)化為T3。另外，在T3和�；悄懰酺CA處理72小時后，HSMM細(xì)胞胞外酸化度均顯著升高，說明耗氧作用導(dǎo)致了酸化增強(qiáng)。

綜上結(jié)果說明，在小鼠棕色脂肪BAT以及人類肌肉細(xì)胞HSMM中，膽汁酸提高D2 mRNA表達(dá)、D2活性以及能量代謝是通過TGR5-cAMP介導(dǎo)的信號通路來完成的。在肝門靜脈提取膽汁酸是非常高效的（70-90%）。斷食階段血清中膽汁酸BA往往低于5 μM，而進(jìn)食后能夠升高到15 μM。這與我們的體外試驗(yàn)中提高cAMP及D2水平的所需膽汁酸的濃度相一致。晝夜血清中膽汁酸水平變化因此可以作為攝食的指標(biāo)，同時也是飲食誘導(dǎo)的能量代謝的關(guān)鍵因子。

圖3 D2下的膽汁酸信號

a，50天后D2野生型小鼠和純合突變小鼠的體重變化。黑框，野生型，高脂飲食（F）；白框，野生型，高脂飲食添加膽酸（FA）；黑圈，D2突變鼠，F(xiàn)飲食；白圈，D2突變鼠，F(xiàn)A飲食。b，epWAT以及BAT重量的比較。c，四氯化鋨染色后BAT的電子顯微鏡分析。標(biāo)尺，5 μM。d，轉(zhuǎn)染pCRE-Luc以及TGR5表達(dá)載體到CHO細(xì)胞中CRE報(bào)告試驗(yàn)。濃度：100 μM BA，5 μM福司柯林（Fo）。C代表對照組。白格，載體；黑格，pTGR5。e，CER報(bào)告載體分析，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞使用pCRE-Luc和TGR5表達(dá)載體，不同BA濃度（1.8、5.5、17 μM）下。f，TGR5（黑框）和D2（白框）在小鼠不同組織中的表達(dá)。ND，無信號。g，小鼠7天飲食后BAT中cAMP水平。Ch，粗飼；ChA，粗飼加膽酸CA。誤差線顯示標(biāo)準(zhǔn)誤s.e.m。

圖4 BAs體外試驗(yàn)結(jié)果

a，飼喂不同糧食14天后小鼠BAT細(xì)胞中D2的表達(dá)（上半截）以及D2的活性（下半截）。白框，粗飼Ch；黑框，高脂飲食HF。細(xì)胞用TCA或者福司柯林Fo處理。b，BAT細(xì)胞中Bas誘導(dǎo)cAMP。GW，GW4064，分別使用濃度1.1、3.3以及10 μM。白框，粗飼Ch；黑框，高脂飲食HF。c，人類組織中TGR5（白框）以及D2（黑框）的表達(dá)。ND，無信號。d，HSMM中TCA（1.3、4、12 μM），GW4064（3 μM）以及福司柯林（10μM）誘導(dǎo)的D2活性。e，HSMM中BAs誘導(dǎo)的cAMP活性。f，CRE報(bào)告試驗(yàn)（方法同圖3d）。激活劑使用濃度1、3.2、10 μM。白框，載體；黑框，pTGR5。G，人工TGR5激活劑（1、5、15 μM）在HSMM中誘導(dǎo)D2活性。白框，不含IBMX；黑框，添加1 mM IBMX。H，HSMM在5 μM TCA及50 nM T3處理下的耗氧（上半截）和胞外酸化率（下半截）。白框，48小時；黑框72小時。誤差線顯示標(biāo)準(zhǔn)誤s.e.m。

參考文獻(xiàn)：Watanabe M , Houten S M , Mataki C , et al. Bile acids induce energy expenditure by promoting intracellular thyroid hormone activation[J]. Nature (London)